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Funktionelle Genomik der vaskulren Schden bei Hypertonie

 


Prof. Dr. Thomas Unger

Teilprojektleiter

 

Prof. Dr. Thomas Unger

 

Charite; Universittsmedizin Berlin / Campus Mitte

Center for Cardiovascular Research

Hessische Str. 3-4

10115 Berlin

email:  thomas.unger@charite.de

Tel:       030-450 525 001

 

 

 

 


Im Rahmen dieses Projekts werden die molekularen Mechanismen vaskulrer Schden bei Hypertension untersucht. Derzeit untersuchen wir die die Rolle der Signaltransduktion G-protein vermittelter Rezeptoren (GPCRs) und Steroidrezeptoren im Gefsystem mit genetisch vernderten Mausmodellen. Die normale kardiovaskulre Entwicklung und Physiologie hngt z.T. von der Signaltransduktion, die durch die GPCRs vermittelt wird, wie z.B. der Angiotensin II Typ 1 Rezeptoren, der Sphingosin-1-Phosphat und Endothelin-1 Rezeptoren, ab. RGS (Regulator of G-protein signaling) Proteine sind GTPase regulierende Proteine, die das Signal ber heteromere G-Proteine abschwchen. Eine Abschwchung der RGS2-Expression kann u.U. die Entwicklung eines Bluthochdruckes begnstigen. Daher erfordert die pathophysiologische Rolle dieses Proteins eine tiefer gehende Analyse. Zustzlich zu den GPCRs sind Mineralkortikoide und der Mineralkortikoidrezeptor (MR) in die Regulation des Blutdrucks involviert. Die Funktion des MR bei verschiedenen Zellen und Geweben der Maus wird mittels der Cre/loxP Technologie untersucht. Ein drittes Projekt untersucht die molekularen Mechanismen der Bildung von Aortenaneurysmen, die eine hufige Komplikation bei lang andauernd bestehendem Hochdruck des Gefsystems darstellen. Die hier beschriebene Analyse konzentriert sich auf die Rolle Kallikrein-Kinin-Systems und Renin-Angiotensin-Systems im vaskulren remodelling.

 

 

Thema 1

Systemische Hmodynamik in RGS-2 defizienten Musen: Die Rolle g-Protein gekoppelter Rezeptoren bei der Kurz- und Langzeitregulation des Blutdruckes und der kardiovaskulren Endorganschdigung.

RGS2 Deletion in Musen verlngert das durch g-Protein Rezeptoren vermittelte vasokonstringierende Signal und erhht dadurch den Blutdruck; nichtsdestotrotz bleiben viele Unklarheiten ber die Blutdruckregulation angesichts der RGS2 Defizienz.

 

 



Abb.1: Vernderungen im mittleren arteriellen Blutdruck ( MAP) nach 1,2 und 3 mg/kg Prazosin in RGS2-/- und RGS2+/+ Musen. Der strkere Blutdruckabfall whrend 1-adrenerger Rezeptorblockade mit Prazosin (1mg/kg) weist auf eine hhere sympathische Aktivitt bei diesen Musen hin. Bei den hheren dosen war der Unterschied weniger ausgeprgt. $: p


Abb.1: Vernderungen im mittleren arteriellen Blutdruck ( MAP) nach 1,2 und 3 mg/kg Prazosin in RGS2-/- und RGS2+/+ Musen. Der strkere Blutdruckabfall whrend 1-adrenerger Rezeptorblockade mit Prazosin (1mg/kg) weist auf eine hhere sympathische Aktivitt bei diesen Musen hin. Bei den hheren dosen war der Unterschied weniger ausgeprgt. $: p<0.05 Grundwert vd. Prazosin (steady state; 40 bis 60 min. nach Injektion) *:p<0.05.



Wir haben die Funktion des autonomen Nervensystems und der Blutdruckregulation in RGS2 defizienten (RGS2-/-) Musen untersucht. Wir haben im Einzelnen den arteriellen Blutdruck und die HF mit Hilfe von Telemetrie gemessen. Wir haben frequency domain Messungen der Blutdruck- und Herzfrequenzvariabilitt (HRV) aufgezeichnet, ebenso wie die Sensitivitt des Barorefexes (BRS-LF), die umweltbedingte Stress-Sensitivitt und die Katecholamin-Exkretion im Urin untersucht.

 

 



Abb.2: Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP) und Herzfrequenz (HR) zeigten einen klar umrissenen Tag / Nacht Rhythmus in beiden Stmmen. In RGS2-/- Musen stieg der MAP um 10mm HG an, whrend die HR unverndert blieb. Dies weist auf einen reset des Barorezeptor Reflexes hin (*p


Abb.2: Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP) und Herzfrequenz (HR) zeigten einen klar umrissenen Tag / Nacht Rhythmus in beiden Stmmen. In RGS2-/- Musen stieg der MAP um 10mm HG an, whrend die HR unverndert blieb. Dies weist auf einen reset des Barorezeptor Reflexes hin (*p<0.05).



Wir schlieen daraus, dass die RGS2 Deletion einen Anstieg des sympathischen Tonus und der Stress-Sensitivitt bewirkt und einen Reset des Barorezeptor-Herzfrequenz-Reflexes bewirkt, whrend die Empfindlichkeit des Barorezeptors unverndert bleibt.

 

 

Thema 2

Rolle des vaskulren Mineralkortikoidrezeptors bei der Blutdruckregulation und der Endorganschdigung.

Man wei, dass Mineralkortikoide und der Mineralkortikoidrezeptor (MR) in die Blutdruckregulation involviert sind. Wir konnten krzlich zeigen, dass Aldosteron die durch Angiotensin (Ang) II induzierte Aktivierung der MAP Kinase potenziert (Mazak 2004). Interessanterweise wurde die durch Angiotensin II induzierte ERK Phosphorylierung durch den MR Blocker Spironolakton inhibiert (Spi, Abb. 3).

 

 



Abb. 3 Ang II induzierte ERK Phosphorylierung hngt vom MR Blocker Spironolakton (Spi) ab.

Abb. 3



Zur Analyse des MR in glatten Gefmuskelzellen haben wir begonnen, den Blutdruck in VSMC Mutanten zu analysieren und die vaskulre Reaktion auf Aldosteron zu messen. Diese Messungen werden in Kooperation mit Prof. Luft in Berlin durchgefhrt. Um ein besseres Verstndnis der Rolle des Steroidhormonrezeptors bei der Geffunktion zu erreichen, kombinieren wir zwei Strategien und Prozeduren, die wir in unserem Labor entwickelt haben: hochspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System (Abb. 4) und BAC transgenes sowie Genexpressionsprofiling mit Amplifikation von RNA im Nanogramm Bereich.

 

 



Abb. 4 Tamoxifen induzierte Cre Aktivitt in SMMHC-iCreERT2 Musen (ROSAlacZ Reporter).


Abb. 4



Mithilfe der ausgereiften Affymetrix Technologie zur systematischen Genexpressionsanalyse haben wir begonnen, das Profil der Genexpression in ausgewhlten Zielzellen zu untersuchen. Zustzlich konnten wir ein lentivirales Vektorsystem zur Expression von RNAi entwickeln. Mit dieser Technologie werden wir in Krze in der Lage sein, dieses vielversprechende System zur schnellen molekulargenetischen Definition der Funktion von Zielgenen zu nutzen, die beim Screening identifiziert worden sind. Kandidatengene werden darber hinaus in Kooperation mit dem MPI in Berlin (M. Janitz/ H. Lehrach, Berlin) untersucht. Diese NGFN-Plattform stellt eine etablierte Methode funktioneller Hochdurchsatz Charakterisierung von Genen zur Verfgung, die auf existierenden Verfahren bei dem Zellen mit Mikroarrays immobilisierter DNA auf Glasplttchen transfiziert werden, dem so genannten transfected cell array (TSA). TSA stellt einen Hochdurchsatz Tool fr die funktionelle Genanalyse in Gefzellen dar. Wir wollen dieses System in verschiedenen Zelllinien und Zelltypen zur Erstellung einer funktioneller Signatur individuelle Gene, die in die Signaltransduktion des Mineralkortikoidrezeptors im Gefsystem involviert sind sowie fr das gesamt Projekt CV1.3 einsetzen.

 

 

Thema 3

Molekulare Signalwege bei der Bildung abdominaler Aortenaneurysmen

Man wei, dass das Kallikrein-Kinik und das Renin-Angiotensin System eine wichtige rolle beim hmodynamischen Stress spielt, der als urschlicher Faktor fr die aneurysmenbildung erkannt wurde. Durch Vergleich von Brown Norway Ratten (BN) genetisch bedingten kiniogen-defizienten Brown Norway Katholik (BN/Ka) Ratten konnten wir krzlich zeigen, dass eine kinikogen-Defizienz die Formation abdominaler Aortenaneurysmen, aber nicht die Atherosklerose, begnstigt (Kaschina et al. 2004, Abb. 5).  Wir haben das Gewebe humaner abdominaler Aortenaneurysmen untersucht und fanden eine aktivierung von Matrix Metalloproteinasen, Cystinproteasen und konponenten des Renin-Angiotensin Systems (Cathepsin D, Chymase, AT1 Rezeptor) ebenso wie eine down-Regulierung des antiproteolytischen Mediators ((TIMP-4 und hochmolekulares Kininogen). Mit Hilfe primrer Zellkulturen (VSMC, EC) konnten wir zeigen, dass doppelstrngiges hochmolekulares Kininogen die durch interleukin-1 alpha in VSMC induzierte MMP-2 Expression abschwchte und dadurch apoptosehemmend wirkte. Weitere Analysen des primren intrazellulren Signalweges durch ein zellulres Transfektions - Array werden in Kooperation mit dem MPI-MG (M. Janitz) durchgefhrt.  

 

Um die mageblichen Prozesse beim Remodelling der Aorta zu untersuchen, haben wir die Expressionsprofile von Geweben chirurgisch behandelter Patienten mit atherosklerotischem Aortengewebe verglichen (Kooperation mit C. Maercker, RZPD). Aufgrund der ergebnisse werden neue therapeutische Strategien bei unseren Ratten angewendet.

 

 



Abb. 5 Abdominale Aortenaneurysmen bei verschiedenen Rattenstmmen: Mnnliche Ratten, 22 Wochen alt, nach 12 Wochen atherogener Dit. Abdominale Aorta,: Querschnitt, Weigert Frbung,  Sirius rot Pikrin Frbung.


Abb. 5 Abdominale Aortenaneurysmen bei verschiedenen Rattenstmmen: Mnnliche Ratten, 22 Wochen alt, nach 12 Wochen atherogener Dit. Abdominale Aorta,: Querschnitt, Weigert Frbung, Sirius rot Pikrin Frbung.



Das bergeordnete Ziel dieses Subprojektes ist, neue Erkenntnisse ber die Genomik des Geftonus und das vaskulre Remodeling bei Hypertonie zu gewinnen. Anstieg des vaskulren Tonus und vaskulre Schden sind die hauptschlichen Faktoren bei der Progression der Hypertonie und der Endorganschden, insbesondere bei Schlaganfall und bei der koronaren Herzerkrankung. In diesem Zusammenhang stellen wir Tiermodelle als eine Ressource fr andere Netzmitglieder zur Validierung von Kandidatengenen bei vaskulren Erkrankungen Verfgung.

 

 



Arbeitsgruppe Prof. Unger

Arbeitsgruppe Prof. Unger



Referenzen:

 

1.    Kaschina E, Stoll M, Sommerfeld M, Steckelings UM, Kreutz R, Unger T. Genetic kininogen deficiency contributes to aortic aneurysm formation but not to atherosclerosis. Physiol Genomics. 2004 Sep 16;19(1):41-9.

 

2.    Otto C, Hein L, Brede M, Jahns R, Engelhardt S, Grone HJ, Schutz G. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 2004 Nov 16;110(20):3245-51.

 

3.   Mazak I et al., Aldosterone potentiates angiotensin II-induced signaling in vascular smooth muscle cells.  Circulation 2004;109:2792-2800. 2. Kaschina E et al., Genetic kininogen deficiency contributes to aneurysm formation but not to  atherosclerosis. Physiol Genomics, 2004;19:41-49

 

4.    Obst M, Gross V, Luft FC. Systemic hemodynamics in non-anesthetized L-NAME- and DOCA-salt-treated mice. J Hypertens. 2004 Oct;22(10):1889-94.

 

5.    Gross V, Obst M, Luft FC. Insights into angiotensin II receptor function through AT2 receptor knockout mice. Acta Physiol Scand. 2004 Aug;181(4):487-94.

 

6.    Bachmann S, Mutig K, Bates J, Welker P, Geist B, Gross V, Luft FC, Alenina N, Bader M, Thiele BJ, Prasadan K, Raffi HS, Kumar S. Renal effects of Tamm-Horsfall protein (uromodulin) deficiency in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2005 Mar;288(3):F559-67.

 

7.    Gross V, Tank J, Obst M, Plehm R, Blumer KJ, Diedrich A, Jordan J, Luft FC. Autonomic nervous system and blood pressure regulation in RGS2-deficient mice Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005 May;288(5):R1134-42.

 

 


Informationen zum Klinikum finden Sie unter:

http://www.ccr.charite.de/ungerP.php

 

 


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